碱基切除修复基因功能变异、DNA氧化损伤与慢性肾功能衰竭的风险机制研究

【摘要】作为遗传物质的DNA易受到机体内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)攻击造成氧化损伤,使生物体内基因变异积累并可能引发基因组的不稳定性,导致衰老、年龄相关性疾病(如神经退行性疾病和肿瘤)的发生。8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)是最为常见的DNA氧化损伤产物之一研究中经常通过测定该产物水平来估测机体的氧化损伤程度。在DNA复制过程中8-OHdG倾向于与腺嘌呤(Adenine,A)而非胞嘧啶(Cytosine,C)配对,导致G:C→T:A的碱基颠换突变,是肿瘤、糖尿病等多种年龄相关性疾病的发病风险因素之一。生物体内普遍存在针对于DNA损伤的修复系统。其中,碱基切除修复系统(baseexcisionrepair,BER)是针对DNA氧化损伤的主要修复途径。碱基切除修复系统是一个多步骤、涉及多种酶的过程,在人类,主要包括三种糖基化酶：MTH1(humanMutThomolog-1)、OGG1(human8-OHdGuanineglycosylase)和MUTYH(humanMutYhomolog)。其中OGG1和MUTYH两种糖基化酶主要参与修复DNA双链中的8-OHdG,分别在DNA复制过程中识别并切除8-OHdG和与之错配的A。碱基切除修复系统基因变异可以影响相应蛋白的功能,导致机体修复功能的下降,从而与多种人类疾病的发生相关。慢性肾功能衰竭(chronicrenalfailure,CRF)已成为一个世界性的健康难题。我国肾脏疾病的发病率呈逐年上升趋势,最新的研究显示我国肾脏疾病总体患病率已达10.8%。氧化应激及由此而引起的氧化损伤累积在肾脏疾病的发生发展,慢性肾功能衰竭的形成过程中扮演了重要作用。较多文献报道,慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者外周血白细胞DNA中8-OHdG含量显著高于正常对照人群；最新的研究提示,DNA损伤修复基因XRCC1多态性变异Arg399Gln可增加携带者慢性肾功能衰竭的发病风险。本研究中,我们选择碱基切除修复基因的4种常见变异：OGG1C.977C>G(rs1052133,Ser326Cys),MTH1c.247G>A(rs4866,Val83Met),MUTYHc.972G>C(rs3219489,Gln324His)和AluYb8MUTYH(rs10527342),分别对慢性肾功能衰竭行维持性血液透析患者和健康对照进行基因变异的筛查,分析碱基切除修复基因变异与慢性肾功能衰竭发病风险之间的关系。同时对患者外周血白细胞DNA中8-OHdG含量,以及患者外周血IL-1p和IL-6含量进行检测,探讨碱基切除修复基因变异、DNA氧化损伤、慢性微炎症与慢性肾功能衰竭发生的风险机制。因此,本研究分为三个部分进行：第一部分：碱基切除修复基因变异与中国人群慢性肾功能衰竭发病风险的研究。作为一种常见的人类疾病,慢性肾功能衰竭已成为一个世界性的健康难题。有证据显示氧化应激是导致肾脏疾病发生的重要因素,氧化损伤能够改变肾小球的结构和功能,因此我们在慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者和健康对照中筛查了碱基切除修复基因OGG1C.977C<G,MTH1c.247G>A,MUTYHc.972G>C和AluYb8MUTYH四个基因变异位点,分析其与中国人群慢性肾功能衰竭发病风险的关系。我们收集了337例慢性肾功能衰竭患者和404例健康体检人群作为正常对照。用琼脂糖凝胶电泳方法区分AluYb8MUTYH插入基因型,用高分辨率溶解曲线方法(High-ResolutionMelting,HRM)对OGG1C.977C<G,MTH1c.247G>A,MUTYHc.912G>C进行基因分型,并通过测序对基因分型结果进行验证。病例-对照分析表明OGG1c.977C>G变异和MTH1c.247G>A变异三种基因型的分布在患者组和对照组之间没有显著差异(P=0.394；P=0.444)；但MUTYHc.972G>C变异位点三种基因型的分布在两组之间具有显著差异(P=0.046),患者组MUTYHc.972GG基因型频率明显高于对照组(P=0.013),患者中G等位基因频率显著高于对照组(P=0.026);AluYb8MUTYH三种基因型的分布在两组之间没有显著差异(P=0.099),但患者组携带AluYb8MUTYH插入的基因型(A/P基因型及P/P基因型)比例显著高于对照组(P=0.034)。同时,在原发性肾小球肾炎患者中、并发贫血或高血压的患者中,MUTYHc.972G>C和AluYb8MUTYH基因变异的发病风险更高。第二部分：碱基切除修复基因变异与慢性肾功能衰竭患者DNA氧化损伤、慢性微炎症的研究氧化应激是导致肾脏疾病发生的重要因素,氧化损伤能够改变肾小球的结构和功能,引起肾脏疾病的发生,进而与慢性肾功能衰竭的发生、发展相关。Tarng,D.C.等的研究表明,慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者的外周血白细胞DNA中8-OHdG含量显著高于正常对照人群,提示慢性肾功能衰竭患者处于较高的DNA氧化应激状态；同时,有研究证实慢性肾功能衰竭患者体内较高的炎症因子水平与患者的高死亡率和不良预后相关。我们对116例慢性肾功能衰竭患者外周血DNA中8-OHdG含量进行检测,并分析其与碱基切除修复基因变异之间的关系,结果显示携带OGG1c.977C>G、MUTYHc.972G>C、AluYb8MUTYH变异位点突变基因型的患者外周血DNA中8-OHdG含量显著高于携带野生基因型的患者。同时我们也检测了167例慢性肾功能衰竭患者和66例正常对照外周血IL-1p和IL-6含量,发现慢性肾功能衰竭患者组外周血IL-1β和IL-6水平显著高于健康对照组,且在患者IL-1p和IL-6水平与MUTYHc.972G>C、AluYb8MUTYH基因变异相关。第三部分：MUTYH基因AluYb8插入变异影响原代培养成纤维细胞抗氧化应激能力的研究本实验室首先发现MUTYH基因第15内含子存在AluYb8片段插入变异,携带纯合AluYb8MUTYH插入基因型的个体定位于线粒体的MUTYH1型蛋白表达明显降低,可能会导致线粒体DNA损伤修复能力下降,但其对机体抗氧化能力的影响及具体机制尚不清楚。本研究使用不同浓度的KBrO3(0mM,1mM,4mM)处理不同基因型(野生型(A/A)、纯合插入型(P/P))的原代培养的人脐带源成纤维细胞,检测处理后不同基因型细胞线粒体膜电位和线粒体拷贝数的变化情况,并利用Western-blotting检测细胞凋亡相关蛋白的表达,探讨不同AluYb8MUTYH基因型成纤维细胞抗氧化应激能力的差异及可能的机制。结果显示原代培养人脐带源成纤维细胞经1mMKBrO3或4mMKBrO3处理24h后,携带纯合插入基因型(P/P)的成纤维细胞线粒体膜电位明显低于野生型(A/A)细胞；经4mMKBrO3处理24h后,P/P基因型细胞表达细胞凋亡相关蛋白p53、p21显著高于A/A基因型细胞,提示P/P基因型细胞已进入早期凋亡,其抗外界氧化应激的能力低于A/A基因型细胞。综上所述,本研究发现MUTYHc.972G>C变异、AluYb8MUTYH插入变异与中国人群慢性肾功能衰竭发病相关；携带OGG1C.977C>G、MUTYHc.972G>C、AluYb8MUTYH变异基因型的患者外周血DNA中8-OHdG含量显著高于携带野生基因型的患者；慢性肾功能衰竭患者组外周血IL-1p和IL-6水平显著高于健康对照,且在患者组外周血IL-1p和IL-6水平与MUTYHc.972G>C、AluYb8MUTYH基因变异相关。同时,通过对原代培养成纤维细胞进行外加氧化应激证实AluYb8MUTYH基因变异影响了细胞的抗氧化应激能力,纯合插入(P/P)基因型细胞抗氧化应激能力低于野生型(A/A)细胞。这些研究结果提示,进行碱基切除修复基因变异人群筛查和发病风险评估,对开展针对性的疾病预防具有重要的借鉴意义。
【作者】蔡振明；
【导师】王亚平；
【作者基本信息】南京大学，内科学，2013，博士
【关键词】碱基切除修复系统；基因变异；DNA氧化损伤；慢性肾功能衰竭；8-OHdG；微炎症；

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